PCR (istraživanje) - primjena. Što je PCR tehnika?

PCR je test koji se koristi u dijagnozi mnogih bolesti. PCR metoda omogućuje prikaz izravne prisutnosti bakterija u organizmu, a posebno njegove DNA. Među ostalim koristi se PCR testiranje u dijagnozi Lajmske bolesti. Što je PCR tehnika? Što je PCR u stvarnom vremenu?

Sadržaj:

1. PCR (testiranje) - što je PCR tehnika?
2. PCR (istraživanje) - primjena PCR metode
3. PCR (istraživanje) - Lajmska bolest
4. PCR (istraživanje) - rezultati. Mogu li biti lažno pozitivni?
5. PCR (istraživanje) - rezultati. Mogu li biti lažno negativni

PCR (lančana reakcija polimeraze) osnovna je metoda koja se koristi u genetskim i molekularnim laboratorijima. Razvila ga je 1983. godine Kara Mullis, koja je za njega 1993. godine dobila Nobelovu nagradu.

Poslušajte o čemu se radi u tehnici PCR testiranja. Ovo je materijal iz ciklusa SLUŠAJTE DOBRO. Podcasti sa savjetima.

Da biste pogledali ovaj video, omogućite JavaScript i razmislite o nadogradnji na web preglednik koji podržava HTML5 video

PCR (testiranje) - što je PCR tehnika?

PCR testiranje sastoji se od višestruke amplifikacije (obično u 30-40 ciklusa) određenog fragmenta DNA, npr. Gena koji kodiraju proteine ​​Borrelia, uz upotrebu enzima polimeraze.

Zatim se koriste posebne molekularne boje kako bi ojačani fragment DNA bio vidljiv. PCR, zbog pojačavanja specifičnih fragmenata DNA, ultra je osjetljiva metoda.

U PCR metodi, DNA fragmenti se pojačavaju pomoću specifičnih parova početnika za dano područje bakterijske DNA. Na primjer, ciljane regije u PCR-u koje se koriste u dijagnozi Lajmske bolesti su geni koji kodiraju proteine, na pr. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Biološki materijal iz kojeg se može izvršiti ispitivanje je:

• krv
• dio kože od migrirajućeg eritema
• cerebro-spinalna tekućina
• sinovijalne tekućine ili iz zglobne hrskavice
• urin

PCR (istraživanje) - primjena PCR metode

Uz dijagnozu lajmske borelioze pomoću PCR metode, moguće je otkriti specifične fragmente DNA drugih mikroorganizama ili ljudi. Stoga se metoda PCR također koristi u:

• dijagnostika i praćenje virusnih infekcija: herpes virusi (herpes virus, herpes zoster virus, Epstein-Barr, citomegalovirus), HIV, virusi hepatitisa (HBV i HCV)
• dijagnostika i praćenje bakterijskih infekcija, posebno onih bakterija koje se ne mogu identificirati putem kultura, npr. tuberkuloze
• dijagnostika i praćenje neoplastičnih bolesti: leukemije, rak dojke, rak debelog crijeva, pluća
• dijagnoza predispozicije za rak: rak dojke i jajnika (geni BRCA1 i BRCA2), kolorektalni karcinom (geni APC i CHEK2)
• dijagnostika genetskih bolesti: hemokromatoza (gen HFE), talasemija (geni HBA1 i HBA2), celijakija (geni HLA)
• testovi očinstva, koji otkrivaju DNK kompatibilnost djeteta i oca

Pročitajte i: Testovi na Lymeovu bolest - kako izgledaju i koja je cijena testova na Lymeovu bolest Western Blot test i Lymeova bolest. Tumačenje rezultata ispitivanja bolesti koje se prenose krpeljima: borelioza, babezioza, bartoneloza, TBE i druge.

Trenutno postoje mnoge modifikacije metode PCR. Primjerice, u dijagnozi lajmske borelioze uglavnom se koriste metode ugniježđenog PCR-a (ugniježđenog PCR-a) i PCR-a u stvarnom vremenu. Potonja je kvantitativna metoda i omogućuje određivanje točnog broja kopija DNA borelije u ispitivanom biološkom materijalu.

PCR (istraživanje) i Lymeova bolest

Serološki testovi osnova su za dijagnozu Lajmske bolesti. Međutim, postoje kliničke situacije zbog kojih bi ovi testovi mogli biti lažno negativni:

• serološki prozor, tj. početno razdoblje infekcije u kojem tijelo još ne proizvodi specifična IgM i IgG antitijela protiv spiroheta Borrelia
• kod osoba s imunodeficijencijom koje ne proizvode dovoljno antitijela
• prisutnost imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena Borrelia spirochetes i njihovih specifičnih antitijela i serološkim metodama sprječavaju otkrivanje antitijela

Ako se kod pacijenta sumnja na simptome Lymeove bolesti, a rezultati seroloških ispitivanja budu negativni, može se provesti molekularno testiranje na temelju PCR metode.

DNA spiroheta Borrelia može se otkriti u ranoj fazi infekcije, jer je tada broj spiroheta u tjelesnim tekućinama najveći.

U dijagnozi lajmske borelioze primarno se koriste serološke metode kao što je ELISA, ali u nekim kliničkim situacijama korisne su genetske pretrage pomoću PCR metode.

Što je duže vrijeme od infekcije, to je manja vjerojatnost otkrivanja bakterijske DNA. Stoga se u nekim slučajevima, prije provođenja PCR testa, bakterije uzgajaju na posebnim podlogama 1-2 tjedna, a zatim se provodi test.

Ovaj se pristup koristi u slučaju sumnje na Lajmsku bolest i prikupljenu likvor. U kasnoj fazi infekcije prikladnije je provesti ELISA test.

PCR metoda ne bi se trebala koristiti u rutinskoj dijagnozi lajmske borelioze zbog nedostatka standardizacije u pogledu pojave sorti Borrelia burgdorferi u Poljskoj.

Međutim, u slučaju poteškoća u dijagnozi (posebno u ranoj fazi bolesti), rezultat PCR testa pomaže u dijagnostičkom procesu.

Pozitivan rezultat testa znači da je u ispitivanom materijalu otkrivena prisutnost DNA Borrelia burgdorferi DNA i njezinih sorti, ali ne objašnjava događa li se u tijelu aktivna infekcija. S druge strane, negativan rezultat ne isključuje prisutnost bakterija u tijelu.

Neki laboratoriji nude ispitivanje prisutnosti borelijske DNA u krpelju. Međutim, rezultat takvog pregleda nije osnova za dijagnozu Lymeove bolesti ujedene osobe.

Preporučeni članak:

ELISA test - što otkriva? Kako pročitati rezultate? Cijena testa

PCR - rezultati. Mogu li biti lažno pozitivni?

PCR je ultra osjetljiva metoda i istodobno vrlo osjetljiva na onečišćenje. Stoga je u testovima temeljenim na PCR-u vrlo važno odabrati odgovarajuću unutarnju kontrolu kako bi se isključili lažni pozitivni rezultati.

Ključ je također ispravno prikupljanje materijala za ispitivanje kao i iskustvo i pouzdanost dijagnostičara koji provodi test.

PCR - rezultati. Mogu li biti lažno negativni

Kao i u bilo kojem laboratorijskom testu, i u PCR metodi mogu se pojaviti lažno negativni rezultati. Ovdje je presudno prikupiti krv za odgovarajući antikoagulant, jer neki od njih, poput heparina, mogu inhibirati PCR reakciju.

Također, prikupljanje materijala nakon početka antibiotske terapije može prouzročiti smanjenje učinkovitosti PCR reakcije i veću vjerojatnost lažno negativnih rezultata.

Također treba imati na umu da bakterije Borrelia vrlo kratko žive u krvi i tjelesnim tekućinama, jer zahvaljujući posebnim receptorima vrlo brzo prodiru na "teško dostupna" mjesta u tijelu.

Stoga je, za razliku od dijagnostike drugih mikroorganizama, broj spiroheta borelije u biološkom materijalu mali, ponekad čak i na granici otkrivanja PCR metode. To također može dovesti do lažno negativnog.

Preporučeni članak:

Test transformacije limfocita (LTT)

Književnost

1. Dunaj J. i sur. Važnost metode PCR u dijagnozi lajmske borelioze. pretraživati Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
2. Laboratorijska dijagnostika bolesti koje se prenose krpeljima. Preporuke radne skupine: Nacionalna komora laboratorijskih dijagnostičara, Nacionalni institut za javno zdravstvo-Nacionalni institut za higijenu, Nacionalni savjetnik za područje zaraznih bolesti, Odjel za infektivne bolesti i neuroinfekcije, Medicinsko sveučilište u Białystoku, Poljsko društvo za virusologiju, Varšava 2014.
3. Ružić-Sabljić E. i Cerar T. Napredak u molekularnoj dijagnozi Lymeove bolesti. Stručnjak vl Mol Diagn. 2017. siječnja; 17. (1): 19-30.
4. Valones M.A.A. i dr. Načela i primjena lančane reakcije polimeraze u medicinskim dijagnostičkim poljima: pregled. Braz J Microbiol. 2009. siječanj-ožujak; 40 (1): 1-11.

O autoru

Karolina Karabin, dr. Med., Molekularni biolog, laboratorijski dijagnostičar, Cambridge Diagnostics Polska Biolog sa specijalizacijom iz mikrobiologije i laboratorijski dijagnostičar s preko 10 godina iskustva u laboratorijskom radu. Diplomirao je na Fakultetu za molekularnu medicinu i član Poljskog društva za humanu genetiku, voditelj istraživačkih potpora u Laboratoriju za molekularnu dijagnostiku na Odjelu za hematologiju, onkologiju i unutarnje bolesti Medicinskog sveučilišta u Varšavi. Titulu doktora medicinskih znanosti iz područja medicinske biologije obranila je na 1. medicinskom fakultetu Medicinskog sveučilišta u Varšavi. Autor mnogih znanstvenih i popularno-znanstvenih djela iz područja laboratorijske dijagnostike, molekularne biologije i prehrane. Svakodnevno, kao specijalist u području laboratorijske dijagnostike, vodi glavni odjel Cambridge Diagnostics Polska i surađuje s timom dijetetičara na CD-u za prehranu. Svoje praktično znanje o dijagnostici i dijetoterapiji bolesti dijeli sa stručnjacima na konferencijama, treninzima te u časopisima i web stranicama. Posebno je zanima utjecaj suvremenog načina života na molekularne procese u tijelu.